هدف گیری ژن بتا گلوبین رده سلولی cos-7 بوسیله حامل لنتی ویروسی به روش نوترکیبی همسان

ژن درمانی با استفاده از روش هدف گیری ژنی (gene targeting) یکی از بهترین روشهای درمان نقائص ژنتیکی نظیر بتا تالاسمی می باشد. بیماری بتا تالاسمی در اثر کاهش یا فقدان سنتز زنجیره بتا گلوبین به وجود می آید. یکی از روشهای درمان موثر برای این بیماری ژن درمانی توسط حامل های لنتی ویروسی می باشد. ظرفیت حامل های لنتی ویروس حدود 10 کیلو باز است. هدف از این تحقیق طراحی و ساخت حامل لنتی ویروس های نوترکیب فاقد عملکرد اینتگراز و حاوی سازه ژنی مناسب برای هدف گیری ژن بتا گلوبین با روش نوترکیبی همسان به منظور ژن درمانی بتا تالاسمی می باشد. آغازگرهای اختصاصی جهت تکثیر قطعات ژنی tk, ushbg, hyg, hbg, neo و dshbg با نرم افزار gene runner طراحی شد. پس از تکثیر قطعات با pcr و برش آنزیمی، این قطعات با استفاده از روش های کلونینگ در حامل های ptz57rt، plgt و plenti-dest به ترتیب کلون و کلون مجدد شدند. صحت کلونینگ قطعات فوق الذکر با استفاده از روش های تائیدی برش آنزیمی و pcr بررسی شد. با روش جهش زائی هدفمند و بهره گیری از روش overlap extension pcr جهشی در ناحیه کاتالیتیک ژن اینتگراز (d64v) ایجاد کرده و جایگزین قطعه طبیعی در پلاسمید plp1 شد. طی انتقال همزمان پلاسمید نهائی به همراه سه پلاسمید کمکی plp1 (طبیعی و نوترکیب)، plp2 و plp/vsv-g با لیپوفکتامین 2000 به درون رده سلولی 293t، لنتی ویروسهای نوترکیب حاوی سازه ژنی مورد نظر تولید شد. تیتر ویروسهای نوترکیب (اینتگراز جهش یافته) در رده سلولی cos-7 با استفاده از real-time pcr بدست آمد. تیتر لنتی ویروسهای اینتگراز جهش یافته پائین تر از اینتگراز طبیعی بود. سلولهای cos-7 با ویروس نوترکیب تراریخت شده و پس از سه هفته غربال آنتی بیوتیکی (هیگرومایسین b، g-418 و گان سیکلوویر) سلولهای cos-7 تراریخت باقی ماندند. dna کلونی های باقی مانده استخراج و با روش pcr انجام نوترکیبی همسان تائید شد. لنتی ویروسها یکی از مناسبترین سیستم ها برای انتقال سازه ژنی به سلولهای هدف در حال تقسیم و فاقد تقسیم مانند سلولهای بنیادی با هدف ژن درمانی بیماریهای خونی نظیر بتا تالاسمی می باشند. استفاده از حامل های لنتی ویروس دارای نقص در عملکرد اینتگراز همراه با نوترکیبی همسان معایب کارائی پائین هدف گیری ژنی و دخول تصادفی ژنوم لنتی ویروس در ژنوم میزبان را برطرف می کند.